INSTITUTO TECNOLÓGICO
DE CD. ALTAMIRANO GRO
LIC: BIOLOGIA
Biología molecular
“Técnicas de la biología molecular"
VI SEMESTRE “A”
INTRODUCCIÓN
En principio se denomina así a todas
las técnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta
pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo (nacimiento de la
Ingeniería genética), amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas
(clonación de fragmentos en bacterias u otros vectores como virus y PCR), corte
de una determinada región con enzimas de restricción para ver si por una
mutación se gana o se pierde un sitio de restricción (análisis de mutaciones
por RFLP o Restriction fragment lengt polymorphism), que siginifica:
diferencias en los tamaños de los fragmentos de restricción debido a
polimorfismos en el ADN entre otras.
Todas estas técnicas tiene diversas
aplicaciones generalmente en el diagnóstico de enfermedades hereditarias,
búsqueda de alelos más o menos frecuentes asociados a una característica que
nos interesa seleccionar, diagnóstico de contaminación bacteriana en alimentos
(detección de Escherichi coli 0257, cepas difrenctes de
Salmonellas, Mycobacterium sp) diagnóstico viral o de infección viral (HIV,
Hpatitis C, PIF, otros), selección de marcadores moleculares para asistir en el
mejoramiento genético de una especie, test de paternidad, diganóstico de identidad
forense, etc.
METODOLOGÍA
10.1 Métodos de purificación
Todos los tipos de macromoléculas biológicas
tienen una característica en común que va a permitir el desarrollo de un método
de separación especifico para ellas. Estos métodos deben ser completamente
biocompatibles para que puedan ser posteriormente útiles al investigador y, al
mismo tiempo, lo suficientemente potentes para permitir el aislamiento de la
molécula deseada de entre un mezcla compleja de multicomponentes que hacen las
veces de “contaminantes” de nuestra molécula en cuestión. En este sentido, la
cromatografía en columna ha demostrado ser una herramienta muy útil ya que se
dispone de varios mecanismos de separación. La modificación de las diferentes
fases estacionarias ya existentes, así como el desarrollo de nuevas es la base
principal para la obtención de las condiciones necesarias para la rápida y
eficiente separación de biomoléculas.
• Cromatografía
de penetrabilidad. El componente básico es una columna empaquetada con una
matriz en gel especial, que son partículas de un polímero orgánico de
estructura tridimensional, que originan una red de poros hidrofílicos
equilibrados con un tampón acuoso. La técnica consiste en que las moléculas de
gran tamaño no penetran por los poros del polímero, por lo que migran mucho más
rápidamente que las de menor tamaño que sí son capaces de penetrar por los
poros de la matriz.
Al principio del desarrollo de la técnica,
se realizaba a bajas presiones por lo que el rango de aplicaciones estaba
restringido debido a los elevados tiempos de separación y su poca resolución.
En la actualidad se han desarrollado matrices de sílica estables a elevadas
presiones que se utilizan columnas de alta presión, para la separación de
biomoléculas en función de su forma y tamaño.
•
Cromatografía de intercambio iónico. Es el método más utilizado para la
separación de ácidos nucleico. El mecanismo básico es el intercambio reversible
de los iones en solución con los grupos funcionales unidos covalentemente a una
fase estacionaria insoluble llamada resina. Por ejemplo, un ácido nucleico con
carga negativa a pH 7,0 se unirá a un intercambiador iónico con grupos cargados
positivamente, pero eluirá de la columna al cambiar al pH del tampón (tampón de
elución) ya que los iones del tampón de elución interaccionan con los grupos
cargados del ácido nucleico o del intercambiador iónico, respectivamente;
primero eluirán de la columna las moléculas cargadas positivamente que no se
unen a la fase estacionaria y posteriormente, al añadir el tampón de elución,
eluirán las moléculas con poca carga negativa neta y luego las de mayor carga
negativa neta.
10.2 Técnicas de hibridación
Southern
blot
En honor de su inventor, el biólogo Edwin Southern,
the Southern blot es un método para sondear la presencia de una secuencia
específica de ADN en una muestra de ADN. Muestras de ADN antes o después de la
digestión de la enzima de restricción se separan por electroforesis en gel y
luego transferidas a una membrana por Blot a través de la acción capilar. La
membrana entonces está expuesta a una sonda de ADN etiquetada que tiene una
secuencia base de complemento a la secuencia de ADN de interés. Protocolos más
originales utilizan etiquetas radiactivas, ahora existen alternativas sin
embargo no radiactivas. Southern Blot es menos utilizada en Ciencias de
laboratorio debido a la capacidad de otras técnicas, tales como PCR, para
detectar secuencias específicas de ADN de muestras de ADN. Estas manchas se
siguen utilizando para algunas aplicaciones, sin embargo, como el número de
copia de transgen en ratones transgénicos, o en la ingeniería de líneas de
células madre embrionarias de gene knockout de medición.
Northern
blot
The northern blot se utiliza para estudiar los
patrones de expresión de un tipo específico de la molécula de ARN como
comparación relativa entre un conjunto de diferentes muestras de ARN. Es
esencialmente una combinación de desnaturalización electroforesis en gel RNA y
una mancha. En este proceso de ARN está separado basado en tamaño y es transferido
a una membrana que luego es sondeada con un etiquetado como complemento de una
secuencia de interés. Los resultados pueden visualizarse a través de una
variedad de formas dependiendo de la etiqueta utilizada; Sin embargo, la
mayoría como resultado la revelación de bandas que representa el tamaño del ARN
detectado en la muestra. La intensidad de estas bandas está relacionada con la
cantidad del objetivo del RNA en las muestras analizadas. El procedimiento es
utilizado comúnmente para estudiar cuándo y cuánto expresión génica ocurre
midiendo cuánto de ese ARN está presente en diferentes muestras. Es una de las
herramientas más básicas para determinar en qué momento y bajo qué condiciones,
algunos genes se expresan en tejidos vivos.
Western
blot
Anticuerpos contra la mayoría de las proteínas se
puede crear inyectando pequeñas cantidades de la proteína en un animal como un
ratón, conejos, ovejas o burro (anticuerpos policlonales) o producido en
cultivos celulares (anticuerpos monoclonales). Estos anticuerpos pueden
utilizarse para una variedad de técnicas analíticas y preparativas.
En western Blot, proteínas en primer lugar se
separan por tamaño en un gel fino entre dos placas de vidrio en una técnica
conocida como SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida sodio Dodecil
sulfato). Las proteínas en el gel luego son transferidas a un PVDF,
nitrocelulosa, nylon o otra membrana de soporte. Esta membrana, a continuación,
puede ser sondeada con soluciones de anticuerpos. Los anticuerpos que se unen
específicamente a la proteína de interés, a continuación, pueden visualizarse
por una variedad de técnicas, incluyendo productos coloreados,
quimioluminiscencia o autorradiografía.
10.3 Clonación de expresión
Una de las más elementales técnicas de biología molecular
para estudiar la función de las proteínas es expresión de clonación. En esta
técnica, ADN de codificación para una proteína de interés se clona (mediante
PCR y enzimas de restricción) en un plásmido (conocido como un vector de
expresión). Este plásmido puede tener elementos de promotor especial a la
producción de la unidad de la proteína de interés y también puede tener
marcadores de resistencia a los antibióticos para ayudar a seguir el plásmido.
Este plásmido puede insertarse en células bacterianas o
animales. La introducción de ADN en las células bacterianas puede realizarse
por transformación (a través de la captación de ADN desnudo), conjugación (a
través de contacto de la célula-célula) o por transducción (mediante vectores
virales). Introducir ADN en células eucariotas, tales como las células
animales, por medios físicos o químicos se llama transfección. Varias técnicas
de transfección diferentes están disponibles, tales como fosfato de calcio transfección,
electroporación, Microinyección y transfección liposoma. ADN también puede
introducirse en las células eucariotas con virus o bacterias como portadores,
este último a veces se llama bactofection y en particular utiliza Agrobacterium
tumefaciens. El plásmido puede integrarse en el genoma, resultando en una
transfección estable, o puede permanecer independiente del genoma, llamado
transfección transitoria.
10.4
Reacción en cadena de polimerasa (PCR)
La reacción en cadena de polimerasa
es una técnica muy versátil para la copia de ADN. En breve, PCR permite una
sola secuencia de ADN que se copien (millones de veces) o alterado de manera
predeterminada. Por ejemplo, la PCR puede utilizarse para introducir sitios de
enzima de restricción o para mutar (cambiar) bases particulares del ADN, éste
es un método conocido como "Cambio rápido". PCR puede utilizarse
también para determinar si un determinado fragmento de ADN se encuentra en una
biblioteca de ADNc. PCR tiene muchas variaciones, como invertir transcripción
PCR (RT-PCR) para amplificación de ARN y, más recientemente, PCR en tiempo real
(QPCR) que permiten la medición cuantitativa de las moléculas de ADN o ARN.
Electroforesis
en gel
Electroforesis en gel es una de las principales herramientas de la
biología molecular. El principio básico es ADN, ARN, y proteínas pueden ser
separadas por medio de un campo eléctrico. Gel de electroforesis en agarosa,
ADN y ARN pueden separarse de tamaño ejecutando el ADN a través de un gel de agarosa.
Las proteínas pueden separarse de tamaño mediante el uso de un gel de SDS-PAGE,
o sobre la base de tamaño y su carga eléctrica utilizando lo que se conoce como
una electroforesis en gel 2D.
Conclusiones
En esta última unidad se
nos enseñaron las distintas técnicas que tiene la biología molecular para hacer
ciencia, y así dar pasó a la tecnología para llevar una mejor calidad de vida. Cabe
mencionar que hay distintas técnicas empleadas por los biotecnologos. Entre las
técnicas más destacadas están la de Souther blot y la técnica de la PCR. la
primera técnica mencionada sirve para detectar una zona especifica da ADN, y la
segunda técnica sirve para la copia de ADN trabajando en ciclos. También está
la técnica del ADN recombinante, en esta técnica tiene que haber material genético
de dos individuos ya sean de la misma especie o de diferente especie.
